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报告基因应用之转录后调控
发布日期:2019/06/04
点击量:70

1.我们可以提供的产品:

A.载体:

C8011:psiCHECK-1

C8021:  psiCHECK-2

E1330:pmirGLO DUAL-Luciferase miRNA target vector

B. 体外转录试剂盒

P1700:T7 RiboMAX Express RNAi system

C.转染试剂:E2311

D.检测试剂:E1910,E2920

E.检测用白板:6005290(纯白板),655098(底透白板)

2.载体选择

a.psiCHECK1

psiCHECK2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

psiCHECK™ -1 和psiCHECK™ -2 载体用于对RNA干扰(RNAi)的早期优化提供快速的定量方法。此载体可监测与报告基因融合的目的基因表达的变化。两种载体都应用海肾萤光素酶作为主要报告基因,目的基因被克隆至海肾萤光素酶翻译终止密码子下游的多克隆位点。由合成的siRNA 或体内表达的shRNA 引发的针对目的基因的RNAi过程,导致融合mRNA 的剪切和随后的降解。推荐C8011用于检测活细胞中的RNAi效果,使用活细胞底物E6481检测酶活性变化,可以持续检测。C8021含有两个报告基因,用于终点裂解检测。

 

c. E1330:pmirGLO DUAL-Luciferase miRNA target vector. pmirGLO Vector 被设计用于定量评估miRNA 的活性,这是通过将miRNA 的靶序列插入到萤火虫萤光素酶基因(luc2)的下游或者3` 端实现的。萤火虫萤光素酶作为主要报告基因,其表达减少意味着内源性的或外源引入的miRNA 与克隆的miRNA 的靶序列发生了结合。这一载体是基于Promega 的双报告基因技术,萤火虫萤光素酶基因(luc2 ) 作为主报告基因,用于监控mRNA 的调节,海肾萤光素酶基因(hRluc-neo ) 作为对照报告基因,用于进行归一化处理和阳性筛选。

3.实验流程

a.拿到选好的实验载体后普通转化,做菌种保存,中量提取,为后续实验准备好载体。

b.分子克隆实验:将靶标UTR克隆入选好的载体,转化提取鉴定正确后,中量提取,准备转染实验。

c. 设置好实验对照,将中量提取好的实验质粒用转染试剂E2311转染到细胞中,转染后24小时将目的siRNA或者miRNA转染到细胞中,24小时后可以开始进行检测。

d.检测流程:如果选用闪光型试剂E1910,E1960,需要去除培养基,洗涤细胞,加入裂解液,至细胞充分裂解,取20ul裂解产物 进行检测,适合样品数量比较少的客户。如果采用辉光型试剂E2920,E2940,只需将检测试剂加入代检孔,等待30分钟即可开始检测,操作比较简单,适合做高通量的客户。

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