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报告基因应用之启动子研究
发布日期:2019/06/04
点击量:49

1.我们可以提供的产品种类:

 

1.载体选择:

a.第一代实验载体现在已经基本停用了,这代载体携带的Promega第一代luciferase基因,该载体几乎未经基因工程改造,载体上的luciferase基因在实验的过程中有很多本底应答,造成背景比较高,现在比较通用的luciferase基因是简写为luc2的基因,去除了很多本底应答。

b.第二代实验载体推出后得到了广泛的应用,现在还有很多人在使用,是目前拥有文献最多的载体。这代载体在选择内参载体时依然选用第一代,首选是pRL-TK的质粒,这个质粒所携带的启动子是这三个内参载体中最弱的一个,内参信号较之另外两个更弱一点,更利于实验结果的比较。

c.第三代载体是最先进的载体,在这里我们可以选择是萤火虫做实验载体还是海肾的做实验载体,与之对应的内参载体也有两种可以选择,同时我们第三代载体做了两种,一种不带筛选标价,另一种带筛选标记。带筛选标记的质粒可以做成稳转细胞株,以方便实验进行,不用反复转染细胞。

2.实验流程:

a.拿到购买的质粒后,普通转化实验,做一个菌种保藏,方便以后永久使用购买的载体。将载体复制后即可开始后续实验。

b.载体构建:进行分子克隆,将待研究启动子构建入选好的实验载体,鉴定正确,质粒中量提取,为转染做准备。

c.细胞实验:设置好实验对照,将中量提取好的实验质粒和对照质粒分别与内参质粒按照合适比例(2:1——50:1)用转染试剂E2311共同转染到细胞中,转染后24小时可以开始进行检测。

d.检测流程:如果选用闪光型试剂E1910,E1960,需要去除培养基,洗涤细胞,加入裂解液,至细胞充分裂解,取20ul裂解产物 进行检测,适合样品数量比较少的客户。如果采用辉光型试剂E2920,E2940,只需将检测试剂加入代检孔,等待30分钟即可开始检测,操作比较简单,适合做高通量的客户。

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