温故知新！BPS Bioscience 的 PARP 解决方案

维持基因组完整性对于正常细胞功能至关重要。在人类中，超过 150 种蛋白质形成了一个复杂的 DNA 损伤反应 (DDR) 网络，该网络不断发现和修复 损伤的DNA (1)。 

其中，PARP (Poly ADPRibose Polymerase) 蛋白家族由 17 个成员组成，它们催化蛋白质的 ADP-核糖基化。PARP 涉及广泛的生物学功能，包括修复 DNA 损伤、维持基因组稳定性、调节染色质重塑、有丝分裂纺锤体组装、RNA 周转、基因表达调节以及 DNA 甲基化等 (2)。 

图1：单个和多个 ADP 核糖化

 尽管这些蛋白质都属于同一家族，但它们显示出截然不同的特征。少数 PARP 仅具有单核糖基化活性（MARylation），而其他 PARP 催化以线性或分支模式发生的多核糖基化（PARylation）（图 1）。PARP 可能主要定位于细胞核、细胞质或两者，并且在大小和结构上存在显著差异，并包含多种多样的功能域（图 2）。值得注意的是，PARP5A 和 PARP5B 除了催化结构域外只有一个大的锚蛋白结构域（因此命名为端锚聚合酶 TNKS1 和 TNKS2，分别对应于 PARP5A 和 B）。其他显著特征包括 PARP1、PARP2 和 PARP3 的严格 DNA 依赖性，以及每种酶的底物特异性。 

图2：PARP家族成员的结构和特点（2）

BPS PARP相关检测试剂盒产品汇总

当受损的DNA结合PARP1和PARP2时，它们会将PAR链添加到它们自己的蛋白质主链上(autoPARylation)，然后再添加到其他DDR蛋白质上，以招募和激活它们(8)。PARylated的PARP1和PARP2随后会从DNA上分离，以便其他PARylated的伙伴可以启动修复过程。目前已批准的一些药物通过与NAD+竞争结合催化位点，降低PARP1和PARP2的活性。如果没有NAD+，PARP就无法进行PARylation并保持与受损DNA的结合，使其免受其他DDR蛋白的影响。这会阻止DNA修复并增加细胞毒性，从而增强这些药物的作用。因此，这类药物的细胞毒性作用主要取决于它们将蛋白质捕获到受损DNA上的效率(9)，尽管科学家最近发现，使用PARP抑制剂将PARP1(而不是PARP2)捕获到DNA会导致细胞毒性增加。因此，在筛选这些药物时，应包括量化PARP捕获能力和区分抑制剂对PARP1或PARP2的选择性的测定。

大多数商业上可用的PARP活性测定法量化目标蛋白质（例如组蛋白）的PARylation，并且一次仅测试一种PARP酶。相比之下，PARPtrap™组合检测试剂盒用于PARP1和PARP2，可以比较同一检测中分子捕获PARP1和PARP2的能力。

该测定使用荧光标记的DNA探针，根据PARP1或PARP2结合发射偏振光。当PARP1或PARP2与DNA结合时，这些探针具有高荧光偏振(FP)。当科学家将NAD+添加到检测中时，PAR化酶从探针上分离，从而降低FP水平。相反，如果他们添加NAD+和PARP抑制剂，则抑制剂的捕获能力会以剂量依赖的方式增加FP。

这种同质、简单的测定法可以结合到高通量药物发现筛选中，以筛选可增强DNA上PARP1或PARP2捕获的分子。PARPtrap™检测让研究人员能够高效地筛选他们的文库，寻找最特异和最有效的抑制剂。

化学发光和比色测定试剂盒是基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的，旨在测量药物分析应用中的PARP活性。在这些测定中，将底物蛋白包被在板上（见图3），然后将生物素化的NAD+混合物与纯化的PARP酶一起添加到优化的测定缓冲液中。链霉亲和素-HRP（辣根过氧化物酶）处理板后，添加适当的HRP底物以产生化学发光或颜色，然后在每个步骤后清洗板。信号强度与附着在组蛋白上的生物素-NAD+的数量成正比。

考虑到PARP1和PARP2之间的高度同源性，很难找到对PARP1具有比对PARP2更好的亲和力的药物。这是理想的，因为PARP2的抑制会导致更严重的副作用(8)。为了减少脱靶活性，研究人员正在筛选靶向PARP1且亲和力高于PARP2的分子。在一组比较AZD5305和Olaparib功效的实验中，BPS Bioscience的科学家能够显示出对PARP1和PARP2的独特抑制作用。实际上，这两种抑制剂对PARP1显示出相似的IC50（7和8 nM）。在分析PARP2时，Olaparib的IC50为0.3 nM，而AZD5305的IC50为100 nM，证明了该分析的精确特异性和灵敏度。

图3：PARP1-3和TNKS1-2催化多核糖基化的化学发光ELISA的原理

图4：PARP介导的蛋白底物的ADP核糖基化

ADP-核糖基化是利用NAD+作为核糖供体，在蛋白质底物中的Glu、Asp或Lys残基的羧基上可逆地添加ADP核糖单元（如图4所示）。为了测量PARP活性，需要使用PARP底物、NAD+、DNA依赖性PARP 1-3的DNA探针和纯化的PARP酶。为确保检测的灵敏度、稳健性和可重复性，必须仔细优化这些组件。以下几点需要注意： 

图5：AlphaLISA^® PARP均相测定的原理

靶向嵌合体或PROTAC的蛋白水解是一种新兴的蛋白质降解技术，它可以通过将感兴趣的蛋白质靶向泛素E3连接酶来促进蛋白酶体介导的蛋白质降解。与传统的小分子介导的蛋白质活性抑制相比，这项新技术具有明显的优势。

PROTAC分子由结合E3连接酶的配体组成，通过接头连接到结合目标蛋白质的配体。一旦形成这样的复合物，它将被引导到蛋白酶体，从而促进目标蛋白质的降解。与传统的药物相比，单个PROTAC可以促进许多蛋白质的降解，因为它会在其目标降解后被回收。

PROTAC的优点在于可以对“难以药物化”的蛋白质进行靶向，这使得它成为一种潜在的替代策略。任何感兴趣的蛋白质都可以使用这种技术作为目标。但是，PROTAC的开发需要几个优化步骤，这些步骤因量化蛋白质降解的技术难度而减慢。

PROTAC优化分析通过直接测量PROTAC介导的复合物形成来绕过这些困难。这种方法能够提供更准确和可靠的结果，从而加速PROTAC的开发和优化过程。

测定原理：所测的PROTAC（这里是阳性对照iRucaparib-AP6）与PARP1和CRBN相互作用，使它们靠近。PARP1含有一个被GSH供体珠识别的GST标记，而CRBN含有一个与抗FLAG抗体结合的FLAG标记的接受体珠。在激发供体珠后，供体珠会产生单线态氧。单线态氧会激发受体珠，并根据相互作用水平发射光。

试剂盒组分

抑制剂/激活剂

参考文献：

1. Wood RD, et al. Human DNA repair genes. Science, 291: 1284-1289 (2001); PMID: 15922366.

2. Ummarino S, Hausman C, Di Ruscio A. The PARP Way to Epigenetic Changes. Genes, 12(3): 446 (2021); PMID: 33804735.

3. Rose M, et al. PARP inhibitors: clinical relevance, mechanisms of action and tumor resistance. Front. Cell Dev. Biol., 8: 564601 (2020); PMID: 33015058.

4. Ali SO, et al. Understanding specific functions of PARP2: new lessons for cancer therapy. Am. J. Cancer Res., 6(9): 1842-1863 (2016); PMID: 27725894.

5. Lord CJ, Ashworth A. BRCAness revisited. Nat. Rev. Cancer, 16(2): 110-120 (2016); PMID: 26775620.

6. Hu Y, Guo M. Synthetic lethality strategies: Beyond BRCA1/2 mutations in pancreatic cancer. Cancer Sci., 111(9): 3111-3121 (2020); PMID: 32639661.

7. Rudolph J, et al. Inhibitors of PARP: Number crunching and structure gazing. PNAS USA, 119(11): e2121979119 (2022); PMID: 35259019.

8. Slade D, Eustermann S. Tuning drug binding. Science, 368(6486): 30-31 (2020); PMID: 32241937.

9. Pommier Y, et al. Laying a trap to kill cancer cells: PARP inhibitors and their mechanisms of action. Sci. Transl. Med., 8(368): 368er7 (2016); PMID: 27797957.