抗体药物的Fc端与FcR结合的定量检测

Fc受体（FcR）位于免疫细胞表面，能够结合抗体的Fc端，在调节免疫防御系统方面发挥着至关重要的作用。Fc受体还会影响治疗性抗体的疗效，因此在药物研发中备受关注。事实上，治疗性抗体的疗效不仅取决于它与靶标的结合力，还取决于它在患者血液中稳定的时间，以及抗体与Fc受体的相互作用是否能有效地引发适当的免疫反应。

治疗性抗体可用于治疗癌症、免疫性疾病或病毒感染。主要包括：细胞因子或细胞因子受体中和抗体，以及结合癌细胞特异性靶点并直接杀死肿瘤细胞的细胞毒性抗体和抗体药物复合物等。针对免疫靶点的抗体旨在增强肿瘤微环境内的免疫反应，如PD-1/PD-L1或CTLA4抗体。

抗体的半衰期受到新生儿Fc受体（FcRn）与IgG的结合的调控，这一受体在IgG的运输和稳态具有重要的调节作用。其他Fc受体通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）机制触发免疫反应，该机制中，自然杀伤（NK）细胞被结合在肿瘤细胞上的抗体激活，随后肿瘤细胞发生裂解。这些Fc受体可根据所识别的免疫球蛋白（Ig）的类型进行分类：Fcγ受体结合IgG，Fcα受体结合IgA，Fcε受体结合IgE。

新的治疗性抗体（主要是IgG类）与FcRn或适当的FcγR的结合一般需要进行优化，以调节其半衰期和与抗体相关的其他生物学效应。

Fcγ受体包含多个细胞外免疫球蛋白结构域， 可与IgG的Fc区域结合。FcγR家族包括FcγRI（CD64）、FcγRIIa（CD32a）、FcγRIIb（CD32b）、FcγRIIc（CD32c）、FcγRIIIa（CD16a）和FcγRIIIb（CD16b），由于分子结构差异，他们与IgG的亲和力有所不同。FcγR家族中有五个是激活性受体，而FcγRIIb则属于抑制性受体。

抗体检查点家族主要表达于先天免疫细胞和B细胞表面，蓝色部分属于激活型FcγR红色部分属于抑制性FcγR。

激活型Fcγ受体其胞浆区域包含两个免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM），其氨基酸序列为YxxL/Ix（6-8）YxxL/I。FcγRI和FcγRIIIa不含ITAM，但通过另一个含有ITAM的膜锚定亚基进行信号传导。

当IgG与激活型受体结合时，ITAM的两个络氨酸残基被胞内Src家族的络氨酸激酶磷酸化，成为SH2结构域含有信号传导蛋白的结合位点，启动信号转导级联反应以产生生物反应。

FcγRIIa（蓝色）和FcγRIIb（红色）的激活和抑制信号传导。

 抑制性FcγRIIb表达于大多数的B细胞中，它可以提供对B细胞的刺激的负反馈调节。该受体含有一个胞内免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）序列，该基序是一个单独的I/VXXYXXL。一旦被磷酸化，它会与含有SH2的酪氨酸磷酸酶如SHP1、SHP2或SHIP结合，拮抗磷酸酪氨酸信号。

FcγR参与多种生物学功能。存在于NK细胞上的受体与附着在感染细胞或侵入病原体上的抗体结合后可以促进感染细胞或病原体的裂解。存在于噬菌细胞上的FcγR与侵入的细菌上的抗体结合后，触发吞噬细菌的过程，而存在于嗜酸性粒细胞上的FcγR会导致脱粒的发生。

治疗性抗体可通过FcγRIIIa激活抗体依赖性细胞介导细胞毒作用（ADCC）。在治疗抗体的优化过程中，通过使用报告基因细胞系，表达靶点的稳转细胞系的共培养试验等基于细胞学的方法可以用于评估抗体的优化效果。

典型的ADCC过程涉及激活表达FcγRIIIa（CD16a）的NK细胞，释放细胞毒素攻击靶细胞两个步骤。人FcγRIIIa在158残基处表现为二态性，其中Val-158变异体编码比Phe-158变异体具有更好的亲和力。FcγRIIIa所介导的ADCC增强了治疗实体瘤所使用的治疗性抗体的功效，并可以作为造血系统肿瘤的直接治疗靶点。

ADCC Bioassay Effector Jurkat Cell Line (F variant; BPS Bioscience #60540) 中FcγRIIIa-F158的过表达情况。左下角：在表达HER2的SKBR-3乳腺癌细胞存在下，抗HER2抗体药物Trastuzumab的ADCC反应。右下角：在SKBR-3和FcγRIIIa-F158/NFAT荧光素酶报告基因细胞系共培养的情况下，不同剂量Trastuzumab的ADCC效应（EC50 = 28.1 ng/ml）。

上图所示的数据说明了使用过表达FcγRIIIa-F158的Jurkat细胞系ADCC检测的有效性。在这个例子中，Jurkat细胞系中的荧光素酶报告基因中受到NFAT（激活T细胞的核因子）响应元素的调控，NFAT调控可以实现定量化检测。将目标细胞与所需的抗体一起孵育后再添加Jurkat细胞，抗体Fc端与FcγRIIIa结合后，NFAT信号通路被激活，这样荧光素酶活性会随着抗体的剂量变化而变化。因此，这种方法可以直接比较不同抗体的ADCC功效。

抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬作用(ADCP)的主要过程是抗体与靶细胞的抗原特异性结合，随后抗体Fc片段与效应细胞（如巨噬细胞）表面FcγR结合，诱导巨噬细胞吞噬疾病细胞，ADCP是治疗性抗体发挥抗肿瘤作用的重要机制之一。

FcγRIIa 是参与ADCP过程的主要 Fcγ 受体，FcγRIIa主要表达于包括中性粒细胞和巨噬细胞在内的髓系效应细胞，并在此效应中发挥重要的活化作用。如 rituximab即有很强的ADCP效应。

FcγRIIa 表现出多态性，其中R131H变异体和IgG1具有更高的亲和力；一方面ADCP效应可诱导效应细胞直接吞噬靶细胞，另一方面，,当 ADCP 效应启动时,巨噬细胞等会将加工过的肿瘤抗原呈递给 T 细胞,从而启动长期的肿瘤特异性免疫。目前抗体的Fc端氨基酸替换增强介导的巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬效应已经被应用于治疗性抗体。

ADCP 效应检测原理

FcγRIIb（CD32b）通常作为B细胞受体（BCR）诱导的B细胞活化的负调节因子。FcγRIIb1和FcγRIIb2是由mRNA剪接产生的两种不同亚型，它们在表达和功能上存在一定的差异。FcγRIIb1具有外显子C1序列，在B细胞表面高表达，由于C1的插入可将受体系在细胞骨架上，因此阻止其内化增加与BCR的作用时间。FcγRIIb2中外显子C1的缺失表达在髓样细胞中，可在配体结合后迅速内化受体。FcγRIIb诱导聚集的免疫球蛋白吞噬并可能作为清除IgG免疫复合物的“汇聚点”。因此，FcγRIIb的生物学功能是抑制抗体依赖性反应并清除免疫复合物。FcγRIIb1信号传导缺陷导致明显的炎症并涉及自身免疫性疾病。

FcγRIIb是治疗B细胞恶性肿瘤的重要治疗靶点。因此，表达FcγRIIb的细胞可用于鉴定和表征抗-FcγRIIb抗体、双特异性T细胞激活剂、ADC或抗-FcγRIIb CAR（嵌合抗原受体）细胞。

FcγRIIb-依赖型的抗体活化（Promega Inc.）

另一方面，FcγRIIb通过交联4-1BB、OX40和CD40等T细胞激活检查点的抗体，增加免疫疗法的有效性。基于FcγRIIb介导的靶向T细胞的抗体交联的共培养检测，可以用于表征检查点抗体的激动剂活性。

如下图所示，CD137/NF-κB报告基因细胞系与FcγRIIb CHO细胞系共培养，验证了抗CD137抗体的激活效力。

在与FcγRIIb CHO细胞（BPS Bioscience #79511）共培养的CD137/NF-κB-reporter HEK293细胞（BPS Bioscience #79289）中，抗CD137抗体的剂量反应。通过CHO细胞表面表达的FcγRIIb与抗CD137抗体的交联，增强了CD137表达的HEK293细胞中NF-κB的激活（红色）。绿色表示对照CHO细胞。

另一项实验中， CHO细胞系中共表达TCR activator (TCRa) 和FcγRIIb（BPS Bioscience #78436）。该细胞系可用于共培养试验，以筛选抗体介导信号通路的调节剂，并鉴定或表征FcγRIIb受体介导的检查点靶点交联的激动剂。如下图所示，FcγRIIb增强了抗PD-1抗体的作用，因为在TCRa/FcγRIIb CHO细胞存在时观察到了PD-1介导的TCR活性抑制，而在对照的TCRa CHO细胞存在时没有观察到这种抑制。

左侧：共培养分析的示意图。右侧：在增加抗-PD-1抗体（BPS Bioscience #101178）的浓度下，使用PD-1/NFAT Reporter Jurkat细胞系（BPS Bioscience #60535）与TCRa/FcγRIIb CHO细胞系（BPS Bioscience #78436）或TCRa CHO细胞系（BPS Bioscience #60539）进行共培养分析。

doi.org/10.1111/ajt.15366

新生儿IgG的Fc中和受体（FcRn）由β2微球蛋白与FCGRT基因编码的MHC I类重链相关。其结构类似于MHC I。FcRn以2:1的比例结合IgG。该受体通过保护IgG免受溶酶体降解并对其进行回收，从而延长IgG在循环中的半衰期。现在可以通过治疗性抗体的工程化改造增加抗体与FcRn的结合，从而提高其半衰期。Evusheld是一种具有延长半衰期的两种抗体的混合物，已被用于治疗COVID-19；而首个一类药物Enbrel则包含与治疗性蛋白TNFα受体融合的Fc结构域，以增加药物的半衰期。

FcRn本身是自身免疫疾病治疗的候选靶点，阻断FcRn/IgG相互作用会加速包括自身抗体在内的IgG的清除。Efgartigimod是一种人IgG1衍生的Fc片段，通过与FcRn的竞争性结合加速病理性IgG的清除，现已用于治疗自身免疫性肌无力症。

左侧：使用生物素标记的高亲和力FcRn（BPS Bioscience #71283）与Fc工程化改造的诱饵蛋白（EC50=1.35 nM）。测试工程化融合蛋白。右侧：使用Fc:FcRn抑制剂筛选比色法检测试剂盒（BPS Bioscience #78501）及FcRn Blocker（BPS Bioscience #101468）抑制FcRn对IgG1的结合。

抗体药物与Fc受体的相互作用是抗体药物发挥作用的重要因素。我们已经开发了一套蛋白质、测定试剂盒、慢病毒和工程细胞系，可以实现定量检测Fc受体激活、ADCC、FcRn结合等。BPS Bioscience将继续通过开发更多创新工具以加速治疗性抗体的研发。