目前，市面上约有35%的药物以GPCRs为靶标，因此，GPCRs被视为重要的药物开发靶标。在药物研发领域，建立GPCR的检测方法和配体筛选仍然是科学家的核心关注点。过去，科学家们通常使用含有受体膜的放射配体结合测定法来筛选靶向GPCRs的化合物。然而，仅依靠结合亲和力数据难以确定化合物是激动剂还是拮抗剂，更重要的是，这种方法无法提供化合物在生理条件下的整体效力。
在过去的几十年里，科学家们一直在努力发展基于信号依赖的细胞功能分析，以提供更为准确和全面的靶向GPCRs的化合物数据。这种方法不仅更加符合生理条件，而且能够更全面地评估化合物对GPCR的影响，从而为药物研发提供更为有力的支持。
理想的GPCR配体筛选方法应当具备简便、无放射性、稳定和均相的特点，并且适用于微孔板筛选（包括96孔、384孔或1536孔），以方便进行机器自动化操作。为了帮助您更好的了解，下面列出几种当前广泛使用的GPCR检测方法。
受体结合实验可用于评估受体与其配体之间的相互作用，如配体与受体的内在亲和力、结合/解离速率以及受体在组织或细胞中的密度。受体结合实验是一种无细胞方法，理论上适用于任何GPCRs筛选，不涉及受体下游的信号传导。传统放射性配体实验比较繁琐，即使是免洗免过滤的SPA方法，仍需使用放射性配体，面临同位素半衰期短和废物处理难题。因此，新兴的非放射性方法如时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）技术得到广泛推广，利用镧系元素Eu3+或Tb3+等长荧光寿命的特点，可以在所有自然荧光消失之后再检测，并且极大地降低背景荧光的干扰，提高信噪比。配体结合后，GPCRs会改变其构象并激活偶联的G蛋白，然后通过下游效应器促进第二信使的生成。为了检测G蛋白活化或G蛋白介导的信号，包括第二信使生成和报告基因激活等实验被称之为G蛋白依赖性功能实验。在图1中，标红的几种检测指标都是当前最常用的，针对不同指标已经发展出多种成熟的检测技术。
GTPγS结合测定直接测量G蛋白的鸟嘌呤核苷酸交换，这是在GPCR激活后发生的早期事件，不受其他细胞过程的放大或调节。在激动剂刺激后，可以测量表达相关GPCRs的细胞质膜上不可水解的GTP类似物（如 [35S]-GTPγS）的积累。第二信使cAMP、IP3/IP1以及Ca2+也是广泛使用的检测指标，目前已经发展了很多检测方法。最初，cAMP和IP3/IP1均采用放射性标记的方法进行检测，并随后开发出了免洗的SPA方法，目前已经推出了TR-FRET检测方案。与Gαq自然耦合的GPCR激活会导致配体依赖的细胞内Ca2+增加。若要以Ca2+作为指标评估Gαi/o、Gαs或Gα12偶联的GPCR激活情况，可通过过表达嵌合G蛋白（Gαqi5或Gαqo5）或杂合G蛋白（Gα16或Gα15）来“切换”信号通路，从而诱导细胞内Ca2+的增加。可以使用细胞渗透性Ca2+敏感荧光染料（如Fluo-3和Fluo-4）结合FLIPR仪器实现高通量筛选，也可以用Ca2+敏感的生物传感器（如水母发光蛋白）产生强烈发光信号。众所周知，GPCRs激活会通过第二信使的响应元件调节基因转录。这些元件包括cAMP响应元件（CRE）、活化T细胞因子响应元件（NFAT-RE）、血清响应元件（SRE）和血清反应因子响应元件（SRF-RE，SRE的一种突变体）。这些元件都位于基因启动子区域，可通过报告基因的方法进行检测。非G蛋白依赖的功能实验主要包括GPCRs受体内化实验、β-arrestin募集实验以及Label-free功能实验，这些实验都是基于活细胞的GPCR功能实验。GPCRs受体内化测定基于受体脱敏现象，通过GRKs磷酸化激活的GPCRs特定位点，引起β-arrestin的募集，导致受体内吞。随着图像化高内涵筛选（HCS）系统的兴起，GPCR内化检测变得可量化。β-arrestin募集是普遍存在的GPCR信号负调控机制，适用于几乎所有的GPCR。对于筛选Gαi偶联GPCR和孤儿GPCR相关药物来说，传统的第二信使检测系统的检测窗口较小，因此β-arrestin募集检测方法尤其有用。目前，已经发展出多种非基于成像的β-arrestin募集检测方法。其中主要有生物发光共振能量转移（BRET）、TangoTM检测（Invitrogen）、PathHunterTM 技术（DiscoveRx）等。
图2 β-arrestin募集检测方法
（A. BRET；B. TangoTM；C. PathHunterTM）无标记技术近年来在全细胞检测领域崭露头角，特别是在GPCR筛选方面。这种方法利用生物传感器将配体诱导的变化转化为光学或电学等可量化的信号，从而综合细胞反应。无标记全细胞检测可监测细胞特征变化，包括粘附、增殖、迁移和细胞死亡。目前主要采用的仪器包括BINDTM和EpicTM（光学）以及ECISTM、xCELLigenceTM和CellKeyTM（电学）。尽管面临假阳性和假阴性的挑战，但结合传统方法，无标记技术有望进一步拓展GPCR在药物发现和开发中的应用。许多GPCRs在质膜上形成二聚体，对信号传导和药理学有深远影响。C类GPCR需要异源二聚化来维持功能。许多A类GPCRs单独表达时可形成同源二聚体，而它们之间的异源二聚化可能导致不同的信号特性。为此人们设计了一些方法来评估化合物对GPCR二聚化的影响，目前已建立的技术包括FRET/BRET、Tag-liteTM和 PathHunterTM GPCR二聚体检测系统。
（A. BRET；B. Tag-liteTM；C. PathHunterTM）GPCR通过激活G蛋白传导外部刺激，引发信号级联。在这个过程中，G蛋白将GDP替换为GTP，导致α和β/γ亚单位解离，触发不同的信号通路。通过不同的激酶，如Src、PLCβ、PKC等，调控小G蛋白/MAPK级联。检测磷酸化蛋白含量对于理解这一过程至关重要。从最初的放射性标记发展到磷酸化特异性抗体，推动了多种免疫分析技术，如Western Blot、ELISA、流式细胞术。其中，TR-FRET检测技术是一种操作简便的均相方法，适合高通量筛选。
药科元(上海)生物技术有限公司是一家专注于高端国产试剂研发和生产的企业，坚定致力于为药物研发和生命科学探索领域的客户提供高质量的检测试剂。针对GPCRs家族，我们可以提供比较完整的解决方案，从前期的细胞株到后续的功能实验检测试剂都涵盖在内，并利用自身的技术优势不断开发新的产品。下图标出了我们针对GPCRs靶点可以开发的部分产品：
（紫色底纹标明药科元可提供方案）
cAMP检测试剂盒
药科元利用自主研发的KeyTec® TR-FRET技术开发了cAMP TR-FRET检测试剂盒，该试剂盒提供一种均相的免疫检测方法来检测样品中的cAMP水平。该方法基于样品中未标记的cAMP和试剂盒中的Biotin-cAMP之间对受体荧光（Rd）标记的抗体结合位点的竞争。当反应系统中没有未标记的cAMP时，Eu-SA与Biotin-cAMP结合，再与Rd标记的抗体结合。一旦Eu被激发，来自Eu的能量就会被转移到cAMP抗体连接的受体荧光上，从而产生强烈的 TR-FRET信号。当样品中未标记的cAMP加入反应体系时，Biotin-cAMP与受体荧光标记抗体的结合被抑制，导致TR-FRET信号下降。检测原理图如下：
图6 KeyTec® cAMP TR-FRET检测试剂盒原理
我们在同等实验条件下，将试剂盒与竞争产品比较，cAMP试剂盒表现了相同的信号窗口，相近的灵敏度。
图7 KeyTec® cAMP检测试剂盒与竞争产品实验结果对比
关于KeyTec® cAMP TR-FRET的详细介绍见
KeyTec® cAMP TR-FRET检测试剂盒。
药科元自主研发了KeyTec® Luminescent系列产品，可以搭配我们的TransKey®信号通路研究细胞株使用，也可以用于自行构建的报告基因细胞株，基本检测原理如图8所示。图8 KeyTec® Luminescent系列产品基本检测原理有针对Firefly-Renilla双报告基因检测开发的
4.胞内蛋白质磷酸化检测试剂盒
本方法的基本原理如图9所示，一对特异性抗体分别偶联了KeyTec® TR-FRET Solar Eu 与 KeyTec® TR-FRET LA，当两个抗体分别与磷酸化蛋白/总蛋白的不同表位结合时，TR-FRET供体与受体靠近到足够近的距离，在外部光源的激发下，供体与受体之间发生能量共振转移；检测特定波长（665 nm）的信号强度即可测定磷酸化蛋白/总蛋白的水平。本系列试剂盒采用了KeyTec® TR-FRET技术，是一种夹心型免疫分析方法，旨在为您提供更为便捷和高效的胞内磷酸化蛋白检测解决方案。
图9 KeyTec® TR-FRET 胞内蛋白质磷酸化检测原理以上是药科元生物提供的GPCR解决方案，如需了解，可以访问我们的公众号相关专题或官网（https://www.vkeybio.com/main），获取更多信息。同时，您还可以在药科元的微信公众号主页输入关键词“购买”以获取销售经理的联系方式进行咨询。
